中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 疾病，包括中風(fēng)、阿爾茨海默病、帕金森病和脊髓損傷 (SCI)，可導(dǎo)致殘疾和死亡，每年影響數(shù)百萬人 。然而，目前尚無治愈性療法來阻止或逆轉(zhuǎn)其進(jìn)展。神經(jīng)干細(xì)胞 (NSC) 移植由于其能夠分化為各種神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞類型且腫瘤發(fā)生風(fēng)險極小，可能成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的下一代治療替代方案。
近日 ，國際權(quán)威期刊雜志《Transplant Immunology》發(fā)表了一項(xiàng)“在腦內(nèi)鑒定同種異體及異種神經(jīng)干細(xì)胞的免疫原性以及減輕移植排斥的策略”的研究[1]。
在這項(xiàng)研究中，我們展示了同基因、同種異體和異種神經(jīng)干細(xì)胞移植引發(fā)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，并評估了環(huán)孢素A（CyA）和甲潑尼龍（MP）對移植物排斥的免疫抑制作用。
研究結(jié)果顯示，異種神經(jīng)干細(xì)胞移植誘導(dǎo)了中性粒細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞 / 巨噬細(xì)胞、CD4+和CD8+T細(xì)胞的浸潤，而同種異體移植主要觸發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的募集。兩種移植類型均導(dǎo)致移植細(xì)胞數(shù)量急劇下降。CyA和MP的聯(lián)合治療顯著減輕了異種免疫排斥反應(yīng)，并顯著增加了腦內(nèi)存活的移植細(xì)胞數(shù)量。同樣，MP單一療法有效降低了同種異體排斥反應(yīng)，提高了移植細(xì)胞的存活率。
總體而言，同種異體神經(jīng)干細(xì)胞移植主要觸發(fā)先天性免疫，而異種移植則引發(fā)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。因此，異種移植需要CyA和MP聯(lián)合治療，而MP單一療法可減輕同種異體移植中的排斥反應(yīng)。我們的研究結(jié)果可能為減輕腦內(nèi)同種異體和異種神經(jīng)干細(xì)胞移植排斥提供了一種策略，從而為各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床前和臨床應(yīng)用中基于神經(jīng)干細(xì)胞的治療優(yōu)化微環(huán)境。
為什么要進(jìn)行這項(xiàng)研究？目前干細(xì)胞治療神經(jīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要挑戰(zhàn)是什么？
目前基礎(chǔ)和臨床研究發(fā)現(xiàn)，源自成人人體的神經(jīng)干細(xì)胞（ahNSCs）在嚙齒類動物模型中對中風(fēng)、阿爾茨海默病和脊髓損傷顯示出積極的治療作用。
然而，將干細(xì)胞療法應(yīng)用于患者仍面臨諸多挑戰(zhàn)，包括細(xì)胞存活率低、人與嚙齒類動物免疫系統(tǒng)的差異，以及移植排斥反應(yīng)。許多研究發(fā)現(xiàn)，免疫反應(yīng)和移植排斥會導(dǎo)致移植物損傷并惡化其功能。此外，嚙齒類動物模型與人類患者移植后的免疫反應(yīng)存在顯著差異，這可能是許多臨床前研究未能轉(zhuǎn)化為人體試驗(yàn)或大型動物模型的原因。
因此，降低移植排斥可能有助于移植細(xì)胞的存活和發(fā)揮療效，并在嚙齒類動物與人類之間創(chuàng)造相似的免疫環(huán)境。
免疫抑制劑已成功用于預(yù)防器官移植中的同種異體排斥反應(yīng)，也可能提高干細(xì)胞的存活率。在我們及其他先前的研究中，環(huán)孢素A（CyA）被用于改善移植ahNSCs的持久性，但其抑制效果并不理想。此外，許多研究表明，將作用機(jī)制不同的免疫抑制劑聯(lián)合使用，對干細(xì)胞治療的效果優(yōu)于單獨(dú)使用CyA。
因此，為延長移植物存活并為移植創(chuàng)造一致的免疫環(huán)境，可針對每種移植類型和實(shí)驗(yàn)條件選擇最佳的免疫抑制劑組合。在多種免疫抑制劑中，甲潑尼龍（MP）作為一種對先天性免疫系統(tǒng)具有廣泛抗炎作用的糖皮質(zhì)激素，與抑制T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的CyA，可能是理想的聯(lián)合用藥選擇。
本研究評估了同基因、同種異基因和異種神經(jīng)干細(xì)胞移植入腦后在體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的差異。基于這些免疫學(xué)差異，分別在同種異基因和異種NSCs移植中，分別單獨(dú)或聯(lián)合使用CyA和MP以最大限度延長移植物存活，并研究其對腦內(nèi)移植免疫應(yīng)答的影響。
什么是異種神經(jīng)干細(xì)胞移植：簡單來說，異種神經(jīng)干細(xì)胞移植就是“把人的神經(jīng)干細(xì)胞種到動物腦子里”，用于模擬人類細(xì)胞治療，但因物種差異會引發(fā)猛烈排斥，是藥物開發(fā)和再生醫(yī)學(xué)研究中的重要工具模型。
神經(jīng)干細(xì)胞的特性
細(xì)胞來源與移植驗(yàn)證：本研究使用了三種來源的神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）：C57BL/6小鼠胎腦（B6NSC，圖1A、B）、ICR小鼠胎腦（ICRNSC，圖1C、D）和成人顳葉（ahNSC，圖1E、F）。
通過H&E染色證實(shí)，這些細(xì)胞被成功移植到免疫活性C57BL/6小鼠的紋狀體內(nèi)。與僅注射緩沖液（出現(xiàn)組織損傷且無細(xì)胞團(tuán)）的對照組不同，注射了三種NSCs的組（同基因B6組、同種異體ICR組、異種ahNSC組）均在注射部位形成了明顯的細(xì)胞團(tuán)。同種異體ICRNSCs和異種ahNSCs的成功移植還分別通過其特異性標(biāo)志物H2Kd和STEM121分別證實(shí)移植成功，表明各組NSCs均已正確注射至紋狀體。
核心特征與分化潛能：無論來源如何，所有三種來源NSC均表達(dá)NSC特異性標(biāo)志物巢蛋白和增殖標(biāo)志物Ki-67（圖1A、C、E）。在未分化狀態(tài)下，一些NSC表達(dá)分化的神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物，包括Tuj1（神經(jīng)元）和GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞）（圖1A、C、E）。
分化后，NSC失去了巢蛋白和Ki-67的表達(dá)，而顯示出發(fā)芽和延伸的神經(jīng)突，即分化神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)（圖1B、D、F）。此外，一些細(xì)胞強(qiáng)烈表達(dá)Tuj1、GFAP、Olig2或O1（圖1B、D、F）。Olig2和O1是少突膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。這些特征（巢蛋白/Ki-67表達(dá)、分化后特定標(biāo)志物表達(dá)和形態(tài)變化）共同證實(shí)了所用細(xì)胞是具有多向分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞。
大腦對移植神經(jīng)干細(xì)胞的免疫反應(yīng)
為評估大腦對不同來源移植神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs：同基因B6、同種異體ICR、異種人類NSCs分別代表自體、同種異體、異種移植）的免疫反應(yīng)（圖2），研究將細(xì)胞注射到C57BL/6小鼠基底神經(jīng)節(jié)，并監(jiān)測至移植后6天。
免疫組化分析顯示，所有移植組均出現(xiàn)CD45陽性白細(xì)胞逐漸增加（圖2A），其中異種移植組在移植后第4天和第6天的白細(xì)胞數(shù)量顯著高于其他組，同種異體移植組在第6天也顯著高于對照組（僅注射緩沖液）。類似增加模式也見于中性粒細(xì)胞（圖2B）、小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（F4/80（圖2C）+、Iba-1（圖2D））以及T細(xì)胞（CD8-（圖2E）、CD4+（圖2F）），尤其異種移植組的中性粒細(xì)胞（移植后2-4天）和T細(xì)胞（移植后4-6天）激增最為顯著。
結(jié)果表明，腦內(nèi)注射本身即可激活先天免疫（如中性粒細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞），同種異體移植會加劇此反應(yīng)，而異種移植則在先天免疫激活后，于移植后1周內(nèi)進(jìn)一步引發(fā)了適應(yīng)性免疫反應(yīng)。
此外，當(dāng)利用針對人類細(xì)胞質(zhì)的免疫組織化學(xué)（IHC）檢測受體小鼠腦內(nèi)的人類神經(jīng)干細(xì)胞（圖S2）以及利用人類特異性序列HS C2N4的PCR檢測（圖2G、H）時，發(fā)現(xiàn)人類細(xì)胞逐漸減少。這與免疫系統(tǒng)的激活相反，提示免疫反應(yīng)可能影響移植神經(jīng)干細(xì)胞的存活。
免疫抑制劑對異種神經(jīng)干細(xì)胞存活的影響
為評估免疫抑制劑對異種（人類）神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）移植后免疫反應(yīng)和細(xì)胞存活的影響，研究使用了靶向先天免疫的甲潑尼龍（MP）和靶向適應(yīng)性免疫的環(huán)孢素A（CyA）。
免疫組化（IHC）顯示，全身性給予MP或CyA+MP組合，在異種移植后1周至3周期間，能顯著減少大腦中CD45陽性浸潤白細(xì)胞的數(shù)量（圖3A）。然而，在CyA組中并未觀察到這種影響 (圖3A)。在異種移植后第2周，CyA+MP組與MP單一療法相比表現(xiàn)出明顯更高的效力 (圖3A)。雖然免疫抑制劑在中性粒細(xì)胞中的作用不明顯（圖3B），但在F4/80（圖4A、B）或Iba-1陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（圖4C、D）以及CD8（圖5A、B）或CD4（圖5C、D）陽性T細(xì)胞群中均觀察到CyA和MP的免疫抑制作用，然而CyA組的CD8陽性T細(xì)胞數(shù)量也顯著減少（圖5A、B）。
此外，研究通過免疫組化（IHC）和PCR檢測發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用環(huán)孢素A（CyA）和甲潑尼龍（MP）進(jìn)行免疫抑制治療，在移植后第1周顯著提高了受體小鼠大腦注射部位人類神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）（圖6A、B）的存活數(shù)量及其特異性基因（HS C2N4）（圖6C、D）的表達(dá)水平；雖然在移植后2-4周，注射部位核心區(qū)細(xì)胞顯著減少，但在其周邊區(qū)域檢測到了更多人類NSCs（圖6E、F），說明移植的人NSCs遷移到附近的腦實(shí)質(zhì)中。總之，結(jié)果表明，先天性和適應(yīng)性免疫的雙重抑制可能為移植的異種移植細(xì)胞在腦內(nèi)的存活創(chuàng)造更有利的環(huán)境。
免疫抑制劑對同種異體神經(jīng)干細(xì)胞存活的影響
在神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的同種異體移植中，大腦中激活了先天免疫（圖2）。因此，通過免疫組化（IHC）分析了靶向先天免疫（MP）和/或適應(yīng)性免疫（CyA）的免疫抑制劑的效果。
免疫抑制效果：在同種異體神經(jīng)干細(xì)胞移植模型中（與異種移植不同），單獨(dú)使用靶向適應(yīng)性免疫的環(huán)孢素A（CyA）、單獨(dú)使用靶向先天免疫的甲潑尼龍（MP）以及兩者聯(lián)用（CyA+MP），在移植后1-3周均能顯著減少腦內(nèi)CD45陽性浸潤白細(xì)胞的數(shù)量（圖7A、B），其中聯(lián)合用藥在第2周的效果顯著優(yōu)于任一單藥。
雖然中性粒細(xì)胞數(shù)量未受顯著影響，但這些免疫抑制劑也能有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（F4/80+（圖8A、B）、Iba-1+（圖8C、D））的激活。特別值得注意的是，移植后第3周出現(xiàn)了T細(xì)胞（CD8+、CD4+）數(shù)量的意外增加（圖9），而所有免疫抑制劑治療方案都能顯著抑制此反應(yīng)，這表明同種異體移植引發(fā)的T細(xì)胞反應(yīng)具有延遲且短暫的特點(diǎn)。
細(xì)胞存活與分布：免疫組化分析顯示，在注射部位核心區(qū)域，各用藥組與對照組之間存活的同種異體神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量沒有顯著差異（圖10A、B）。然而，在注射部位的周邊區(qū)域，接受MP單藥或CyA+MP聯(lián)合治療的組中，檢測到的存活同種異體神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量顯著多于對照組，且MP單藥與聯(lián)合用藥組在此區(qū)域的效果相當(dāng)。這表明免疫抑制治療（尤其是針對先天免疫的MP）更有利于移植細(xì)胞在注射點(diǎn)周圍腦組織中的存活或擴(kuò)散。
神經(jīng)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的核心機(jī)制與免疫排斥挑戰(zhàn)
NSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的核心機(jī)制在于其免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)營養(yǎng)旁分泌活性，這高度依賴移植細(xì)胞的存活。盡管大腦具有免疫豁免特性，但移植排斥仍是限制NSCs存活和功能的關(guān)鍵障礙。臨床前（動物模型）和臨床（患者）研究中觀察到的不同免疫反應(yīng)模式，阻礙了成人源NSCs（ahNSCs）研究的轉(zhuǎn)化，凸顯了研究并抑制腦內(nèi)移植排斥的重要性。
同基因、同種異體和異種NSCs體內(nèi)移植會引起的腦內(nèi)免疫反應(yīng)差異？
免疫反應(yīng)強(qiáng)度與模式差異：研究評估了三種神經(jīng)干細(xì)胞移植（同基因、同種異體、異種）后大腦的免疫反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)異種移植引發(fā)最強(qiáng)烈的排斥反應(yīng)（尤其炎癥細(xì)胞浸潤最多），同種異體移植次之。免疫細(xì)胞浸潤呈現(xiàn)時序性：異種移植中，中性粒細(xì)胞最早（立即至2天）并強(qiáng)烈浸潤，隨后巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞（4-6天）和T淋巴細(xì)胞（4-6天）依次增加，此模式與同種異體胰島移植的長期免疫反應(yīng)階段劃分相似。
同種異體移植特點(diǎn)與基線免疫激活：與異種移植不同，同種異體移植主要激活先天免疫（顯著的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞浸潤），而中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞早期（6天內(nèi)）浸潤與自體移植無差異；T細(xì)胞浸潤延遲至移植后第3周出現(xiàn)，但短暫且第4周消退。此外，陰性對照（僅注射緩沖液）和同基因組也觀察到先天免疫細(xì)胞（CD45+白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞）浸潤，表明注射操作本身即可觸發(fā)先天免疫反應(yīng)，可能影響所有類型移植（包括同基因）細(xì)胞的存活。
同種異體移植與異種干細(xì)胞移植的免疫抑制劑效果與局限性有哪些？
同種異體移植：針對先天免疫的MP單藥或聯(lián)合CyA+MP均能有效減少CD45+白細(xì)胞及小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞浸潤，顯著提高移植細(xì)胞在注射點(diǎn)周邊組織的存活率。單獨(dú)使用針對T細(xì)胞的CyA效果不佳，支持了同種排斥主要依賴先天免疫的觀點(diǎn)。
異種移植：需要同時抑制先天和適應(yīng)性免疫。CyA+MP聯(lián)合方案在減少多種免疫細(xì)胞（CD45+白細(xì)胞、T細(xì)胞、小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞）浸潤和提高早期（1周）細(xì)胞存活率方面效果最佳，并能促進(jìn)細(xì)胞向周圍腦組織遷移。但即使聯(lián)合用藥也無法完全消除排斥，提示存在其他未被阻斷的排斥通路。
影響神經(jīng)干細(xì)胞存活的其他關(guān)鍵因素與研究意義
NSCs存活還受多種非免疫因素影響，如：移植細(xì)胞形態(tài)（神經(jīng)球優(yōu)于單細(xì)胞）、移植部位（海馬優(yōu)于紋狀體）、疾病模型/微環(huán)境（影響最佳移植時間窗）、宿主營養(yǎng)支持以及注射操作導(dǎo)致的BBB破壞（使細(xì)胞更易被識別）。免疫抑制療法被證實(shí)對提高同種和異種移植物的存活是必要且有效的。
研究結(jié)論指出：我們證明異種NSCs移植在腦內(nèi)引發(fā)了最強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，觸發(fā)了先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，而同種異體NSCs移植主要引發(fā)先天性免疫反應(yīng)。鑒于此，在以異種移植為主的非臨床試驗(yàn)中，CyA和MP聯(lián)合應(yīng)用效果最佳；而在以同種異體移植為主的臨床試驗(yàn)中，單獨(dú)使用MP的療效與聯(lián)合應(yīng)用相當(dāng)。
我們的研究或可為減少腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞移植排斥反應(yīng)提供方法，并為NSCs治療各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病后的臨床前和臨床研究創(chuàng)造最佳環(huán)境。
主要參考資料：
[1]:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966327425000759?via%3Dihub#f0050
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